Методы анализов кормов: мокрая химия — расширенный анализ состава корма (Ван Соест и др.)

В целом разделяют две больших группы веществ:

1. Содержимое клеток растений. В них содержатся:

• Сырой протеин
• Сырая зола
• Сырой жир
• Часть фракции БЭВ: неструктурные углеводы сахар и крахмал, а также “органический остаток”

2. Клеточные стенки. Эта группа включает прежде всего структурные углеводы и подобные вещества (часть фракции БЭВ и сырая клетчатка из анализа по Венде): нейтрально детергентная клетчатка, кислотно-детергентная клетчатка, кислотно детергентный лигнин.

Определение содержания крахмала и сахара в корме

Метод для крахмала базируется на двойном определении. При первом определении пробу обрабатывают разбавленной соляной кислотой при температуре кипения. После очищения (взвешенные частицы в растворе связываются химически) и фильтрации измеряют оптическое вращение раствора методом поляриметрии.

При втором определении пробу экстрагируют этанолом (40%). После обработки фильтрата соляной кислотой здесь также очищают, фильтруют и измеряют оптическое вращение раствора при одинаковых условиях, как при первом измерении.

Разница между двумя измерениями, умноженная на известную постоянную, дает содержание крахмала в пробе в процентах.

При этом методе используется тот факт, что крахмал активен оптически. Он в состоянии поворачивать плоскость поляризованного света (свет плоскости вибрации) на определенный угол. Этот угол поворота можно определить при помощи поляриметра (оптический измерительный прибор).

Определение сахара происходит посредством полной инверсии измерительно-аналитическим способом (определение титрованием) по методу Луффа-Шоорла. Полная инверсия объясняется тем, что сахар (сахароза) также активен оптически. Он поворачивает плоскость поляризованного света направо.

При обработке разбавленной кислотой сахар распадается на смесь глюкозы и фруктозы. При этом направление оптического вращение меняется на противоположное. Раствор становится не правовращающимся, а левовращающимся (инвертированный сахар).

В методе по Луффу-Шоорлу соли меди (ІІ), которые используются как в избытке, так и в точно известной концентрации, снижаются до оксида меди (І) в реакции с инвертированным сахаром. Не использованная медь (ІІ) определяется посредством титрования. Содержание сахара в пробе рассчитывается по расходу раствора для титрования.

Аналитика структурной клетчатки

Анализ по Венде (HENNEBERG & STOHMANN 1864) служит многие десятилетия для характеристики кормов. Но сырая клетчатка не соответствует фактической клетчатки корма, когда под понятием «клетчатка» подразумеваются полимерные вещества, которые не могут расщепляться пищеварительными ферментами позвоночных животных (VAN SOEST & ROBERTSON 1980). Это ведет также к тому, что содержание неструктурных углеводов оценивается ошибочно, поскольку обычно рассчитывается в виде разности БЭВ = СВ – СЗ — СЖ – СП – СК. Причина кроется в очень разных в обоих методах реагентах, которые приводят к разным растворам питательных веществ анализируемого корма. Общее во всех методах то, что следующие один за другим шаги химической обработки неструктурная часть растворяется, а клетчатка определяется как остаток.

Сырая клетчатка

Под сырой клетчаткой понимают часть кормового сырья, свободную от золы, которая остается после обработки разбавленной кислотой и щелочью. Пробу в два шага по 30 минут варят в 1,25% растворе серной кислоты и 1,25%-ом растворе NaOH или КОН. После этого проба обезжиривается ацетоном, высушиватеся и обеззоливается (VDLUFA 1976). Обезжиривание и обеззоливание используется также при детергентном анализе Ван Соеста. Органическая часть остатка дает содержание сырой клетчатки. Изначально она должна описывать менее переваримые углеводы, в то время как под безазотистыми экстрактивными веществами – рассчитанными как разница – понимаются более хорошо переваримые углеводы. Во времена HENNEBERG и STOHMANN (1864) обычным было название «древесная клетчатка». В их «Предложение для обоснования рационального кормления жвачных животных» они рекомендуют использовать понятие «сырая клетчатка».

Исследования VAN SOEST (1977) показали, что обработка кормового сырья кислотой и щелочью в соответствии с методом определения сырой клетчатки в результате не дает полного содержания «клетчатки». Скорее даже большая часть гемицеллюлозы и лигнина растворяются, также часть целлюлозы переходит в раствор.

Как показано в таблице 1, степень растворения лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы в анализе сырой клетчатки сильно зависит от принадлежности кормового сырья к определенной ботанической группе или виду растений. В среднем у бобовых культур растворяется 30% лигнина, у трав – 82% лигнина, у других видов (особенно у сложноцветных и зонтичных) – 52%. Касательно гемицеллюлозы – растворяется 63, 76 и 64%, а целлюлозы – 28, 21 и 22% соответственно.

Таблица 1. Доли (%) лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы, которые расщепляются в процессе определения сырой клетчатки (VAN SOEST 1977)

Таким образом, аналитика сырой клетчатки не в состоянии точно определить волокнистые вещества кормового сырья (как сумму целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина).

Наиболее неблагоприятным последствием этого является то, что безазотистые экстрактивные вещества, содержат не только легкоусвояемые углеводы, но также трудно перевариваемые углеводы и лигнин. Следствием этого может быть то, что усвояемость сырой клетчатки выше, чем у безазотистых экстрактивных веществ (VAN SOEST 1975). Это означает, что четкое и очень важное для кормления жвачных животных разделение на волокнистые и неволокнистые углеводы было и остается невозможным при работе с сырой клетчаткой.

Детергентная клетчатка

Модель стенки клетки по Алберсхайму (NULTSCH 2001)

Чтобы определить фактическое содержание волокон в растении, т.е. содержание нерастворимой матрицы клеточных стенок, Ван Соест разработал так называемый детергентный анализ (VAN SOEST 1963a, 1963b, 1964, 1965, VAN SOEST & WINE 1967, GOERING & VAN SOEST 1970). С его помощью стало возможным правильное разделение углеводов на волокнистые вещества (клеточные стенки) и неволокнистые вещества (содержимое клеток) (VAN SOEST 1967). Содержимое клеток (растворимые углеводы, крахмал, органические кислоты, белок), а также пектин (средняя ламелла) являются более или менее полностью усваяемыми (90 — 100%), в то время как клеточные стенки могут использоваться организмом только через микробную ферментацию в преджелудках.

Уровень расщепления в процессе микробной ферментации зависит от степени лигнификации. Сама лигнифицированная фракция, а также кутин, кремний, дубильные вещества и т. д. являются полностью недоступными (VAN SOEST 1994). Детергентный анализ также позволяет разделить волокна на их основные компоненты, а именно целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин.

Основным препятствием для получения части клеточных стенок растений, в которых содержатся неперевариваемые вещества, является удаление загрязняющего протеина. По этой причине при определении сырой клетчатки используется гидроксид натрия. Но, к сожалению, при этом удаляется не только протеин, но и гемицеллюлоза и часть лигнина. В разработанном Ван Соестом методе анализа используются детергенты, способные образовывать растворимые протеиновые комплексы, благодаря чему они удаляются.

Нейтрально-детергентная клетчатка (NDF)

Совокупность волокнистых веществ, т.е. остаток после варки в растворе нейтрального детергента (NDS, neutral detergent solution) называется нейтрально детергентной клетчаткой (NDF). При этом содержимое клеток при этом растворяется. Детергентный раствор состоит из лаурилсульфата натрия, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и триэтиленгликоля, а также буферов бората натрия (буры) и дигидрофосфата натрия для регулирования кислотности среды (рН = 7). Точное поддержание нейтрального pH имеет решающее значение, так как кислотная или щелочная среда может растворить волокна. При этом необходимо соблюдать диапазон pH от 6,95 до 7,05.

Первоначально метод NDF был разработан для определения волокнистых веществ в грубых кормах. Более высокие уровни крахмала в концентрированных кормах мешают анализу NDF или приводят к повышенным значениям NDF. Следовательно, при высоких уровнях крахмала обязательным является удаление крахмала термостабильной амилазой в дополнение к триэтиленгликолю (VAN SOEST et al., 1991). Как тип используемой амилазы, так и ее применение во время анализа влияют на значение NDF (MERTENS 2002). Лучшим решением оказалось использование в процессе экстракции термостабильной амилазы. Использование амилазы в анализе волокнистых веществ обозначается буквой «а», т.е. аNDF.

Метод NDF с момента его создания претерпел несколько модификаций. Это было необходимо, потому что некоторые реагенты больше не были разрешены по причинам влияния на здоровья и потому что метод, первоначально разработанный для грубых кормов, был расширен и на концентрированные корма. Основные модификации описаны VAN SOEST et al. (1991) и MERTENS (2002). Терминология для определения используемого метода NDF была определена UDEN et al. (2005).

Пектин

Пектины полностью растворяются при варке в нейтральном детергенте, даже если они являются частью клеточных стенок. Это часто рассматривается как слабое место данного метода анализа. Растворение пектина обусловлено действием ЭДТА. Но по мнению VAN SOEST и соавт. (1991), пектины занимают особое положение, поскольку они быстро и полностью расщепляются микробами рубца. Это показывает, что, в отличие от гемицеллюлозы, они не ковалентно связаны с лигнифицированным матриксом клеточных стенок. Поэтому их называют растворимой в нейтральном детергенте клетчаткой (NDSF, neutral detergent-soluble fiber) (HALL 2003).

Кислотно детергентная клетчатка (ADF)

Гемицеллюлозa полностью нерастворимa в нейтральном растворе детергента (при рН = 7), но легко растворяется при кислотном и щелочном рН (VAN SOEST & ROBERTSON 1977). Обработка образца катионным детергентом цетилтриметиламмонийбромидом (ЦТАБ) в 1 N серной кислоты (раствор кислотного детергента = ADS) растворяет гемицеллюлозу и большую часть белка. ЦТАБ представляет собой соединение четвертичного аммония с длинноцепочечной алкильной группой и служит комплексообразующим агентом. Остаток называется кислотно-детергентной клетчаткой (ADF). Оставшийся белок (ADIN) не считается доступным для рубцовых микробов (KRISHNAMOORTHY et al., 1982).

Содержание гемицеллюлозы рассчитывается по разнице NDF минус ADF. Таким образом, ADF больше не содержит всю клетчатку, но служит для того, чтобы разделить ее на лигноцеллюлозу и гемицеллюлозу. Кислотно растворимая фракция содержит преимущественно гемицеллюлозу и белок клеточных стенок, в то время как остаток содержит целлюлозу, лигнин и наименее усваиваемые неуглеводы (VAN SOEST 1994).

В процессе определения ADF удаляются многие вещества, которые мешают анализу компонентов клеточных стенок. Поэтому, остаток ADF очень полезен для последовательного определения лигнина, кутина, целлюлозы, неперевариваемого азота и кремния.

Часто ADF определяли вместо сырой клетчатки и также использовали в уравнениях регрессии для прогнозирования переваримости. Однако, поскольку ADF представляет собой только часть клетчатки, отношение между ADF и усвояемостью согласно VAN SOEST (1994) носит преимущественно статистический характер и не основано на биологических взаимосвязях между показателями. Перевариваемость и состав клетчатки в гораздо большей степени определяются условиями окружающей среды во время роста растений (температура, свет, широта, вода, удобрения, почва) (VAN SOEST et al., 1978).

Кислотно детергентный лигнин

Гигер (1985) выделяет три метода анализа:

• прямые гравиметрические методы растворением целлюлозы (первоначально метод Клэйсона);
• косвенные гравиметрические методы из разницы после удаления лигнина;
• измерение поглощения в продуктах окисления лигнина.

В принципе, метод Класона состоит из обработки растворителями и последующим раствором 72% серной кислоты (THEANDER & WESTERLUND 1986). Лигнин является нерастворимым остатком. Метод Класона первоначально был разработан для анализа древесины.

Значения лигнина по Класону в травах обычно в 2-4 раза выше, чем значения ADL и только на 30% выше в бобовых (JUNG et al., 1997). Эти авторы сравнили лигнин по Класону и ADL касательно их влияния на переваримость сухого вещества и NDF для широкого перечня видов растений и обнаружили, что оба метода анализа приблизительно эквивалентны в прогнозировании переваримости, хотя значения лигнина заметно различались.

Метод ADL состоит из двух этапов. В обработке раствором AD (кислотный детергент, см. ADF) с помощью ЦТАБ удаляются протеин и другие компоненты клетки, а также гемицеллюлоза с помощью кислоты. Остаток ADF обрабатывают 72% серной кислотой в течение трех часов, тем самым растворяя целлюлозу. Высушенный органический остаток (определяемый озолением) обозначается ADLsa (sulfuric acid, серная кислота). Если лигнин определяется косвенно и растворяется в K-перманганате (ADLpm, перманганат), получается содержание лигнина из разницы остатка ADF за вычетом углеводного остатка (VAN SOEST & WINE 1968).

Непрямые методы определения ADL связаны с риском того, что при окислении лигнина могут раствориться и нелигниновые углеводы (особенно остатки гемицеллюлозы и пектина. С другой стороны, прямой метод растворяет некоторые компоненты лигнина. В результате значения ADLpm примерно на 20% превышают значения ADLsa (VAN SOEST & WINE 1968). Разница ADF минус ADL указывает на содержание целлюлозы.

О том, как применяется детергентный анализ в Корнеллской системе чистых углеводов и протеина (CNCPS), как определяют различные фракции протеина и углеводов, мы поговорим в следующей статье данной серии.